。氮吹儀操 作過程與菌落原位雜交基本相似。氮吹儀硝酸纖維素膜上的菌落裂解后，固 定蛋白質并用相應的抗體檢測菌落。 --對篩選出的基因工程菌還需要進行結構分析鑒定。提取基因工程 菌中的質粒，用限制酶切，經凝膠電泳檢測插入片段的大小，作物理圖 譜。更可靠的方法是作 345的序列分析。 --（五）外源基因的表達 --載體依據功能的不同可分為克隆載體和表達載體兩類。克隆載體 以復制基因，增加基因的拷貝數為目的。只需要具備復制子、多克隆位 點和篩選標志。表達載體不僅要復制外源基因，還要表達外源基因。除需具備克隆載體的條件外，還要有 基因表達的調控序列。 --原核細胞中基因表達的調控元件有以下幾種： --（F）啟動子 -啟動子是 345上轉錄起始位點上游的一段序列，是 M45聚合酶的識別和結合位點（見 第十三章）。原核細胞基因工程采用的強啟動子包括色氨酸操縱子啟動子， !噬菌體左向和右向啟動子， D; 噬菌體的啟動子等。 --（7）N3序列 -N3序列是 .M45翻譯起始點上游的一段序列，該序列和核糖體小亞基上 FO N "M45 的 PQ端的堿基互補，是核糖體的結合位點（參見第十四章），N3序列和翻譯起始點之間的距離影響翻譯的 效率。 --（P）終止子 -利用強啟動子表達外源基因時，在外源基因的下游必須加入不依賴 !因子的轉錄終止 圖 F; 8-菌落原位雜交 第十七章 ,基因技術#"! 子，以防轉錄的“通讀”并提高質粒的穩定性。終止子是 !"# $%端的一段序列，具有終止轉錄的功能。終 止子轉錄出來的 &’"#能形成莖環結構，并緊接著多聚 (，形成轉錄終止信號。 ,,用于原核細胞基因工程的表達

載體，根據基因表達的蛋白質 是否與細菌蛋白融合型分為非融合蛋白表達載體和融合型蛋白 表達載體。非融合蛋白載體表達的產物，結構和生物學功能都接 近天然產物，缺點是易被細菌蛋白酶降解。融合蛋白載體表達的 蛋白質不被細菌蛋白酶降解，可用針對原核蛋白的親和層析純化 融合蛋白。但純化后還需要采取措施從融合蛋白上切下所需要 的蛋白質或多肽（圖 )* +）。 ,,不論是融合型表達載體還是非融合型表達載體，操作時都要 注意不能改變外源基因的開放閱讀框架。 ,,大腸桿菌是最常用的基因表達系統，由于缺少轉錄后的加工 系統和翻譯后的加工系統，真核基因在大腸桿菌中轉錄和翻譯后 都不能進行加工，使它的應用受到一定的限制。可選擇昆蟲細胞 和哺乳動物細胞替代大腸桿菌作為表達系統。哺乳動物細胞作 為表達系統具有如下優點： （)）重組質粒轉染的細胞具有遺傳的 穩定性和可重復性；（-）哺乳動物細胞能對外源基因轉錄的 ./’"#剪切加工成成熟的 &’"#；（$）對表達的蛋白質能進行轉 錄后的加工，如糖基化；（0）可將表達產物分泌到培養基中方便 下游的提純。 ,,基因工程技術在醫藥衛生領域中的廣泛應用促進了醫學的 進步與發展。基因工程疫苗因剔除了致病基因，比傳統疫苗安 全，也沒有血液制品的潛伏交叉感染的危險。由基因工程技術生 產的生物制劑，如干擾素、白介素、多種細胞生長因子等已經投入 臨床使用。基因診斷、基因治療都離不開基因工程技術。基因工程技術為生命科學和醫學研究提供了新 的方法和手段。 第二節 ,分子雜交 ,,分子雜交（&12345267 .897:;:<6=:1/）是基因工程和分子生物學的重要技術之一，也是基因診斷中最常用 的技術。 ,,分子雜交以 !"#的變性和復性為理論基礎。 !"#在某些理化因素的作用下堿基對間氫鍵破壞，由 雙鏈變成單鏈的過程謂之 !"#變性。變性 !"#的單鏈重新合成雙鏈的過程為 !"#的復性。分子雜交 是指不同來源的單鏈核酸通過堿基互補形成雜合雙鏈的過程。其中的一條單鏈雜交前要進行標記，稱為 探針。分子雜交中探針的濃度大于待測核酸的濃度，以保證探針與 !"#充分雜交。 一、核酸探針 ,,核酸探針（>7193）是分子雜交的技術基礎，它是一段與被檢測的核酸序列互補的帶有標記的核苷酸片 段，長度一般為十幾到幾千個堿基不等。探針標記的方法分為： ,,（一）放射性同位素標記 ,,用于標記核酸探針的同位素主要是

 $-?， $-?標記的探針廣泛用于各種濾膜雜交，它的放射活性高，能 釋放 !粒子，穿透力強，通過放射自顯影，靈敏度高，需要時間短，但它半衰期短，標記的探針最好在一周內 圖 )* +,基因工程表達的蛋白質電泳圖 "!!第三篇 !遺傳信息的傳遞 使用。 !!（二）光敏生物素標記 !!光敏生物素（"#$%$&’$%’(）是一種光敏化合物，通過一個連接臂，一端連接生物素，另一端連接化學性 質活潑的光敏基團。在強可見光下，光敏基團與核苷酸特定部位共價結合，合成光敏生物素標記探針。 !!（三）地高辛標記物 !!地高辛（)’*$+’*,(’(，-’*）是類固醇半抗原化合物，通過一個 ..個碳原子的交聯臂與尿嘧啶核苷酸的 嘧啶環上的第 /位碳相連，形成地高辛標記的尿嘧啶核苷酸。地高辛標記的效率高，一般每 01 20/個核 苷酸（(%）中就帶一個地高辛配基，雜交后又有靈敏的免疫酶學檢測系統，靈敏度高，有取代生物素標記探 針的趨勢。 !!（四）分子信標 !!分子信標（3$4,56478 &,75$(）是根據核酸堿基配對原則和熒光共振能量轉移現象設計的。分子信標 長約 0/ (%，空間結構呈莖環形，其中環序列是和靶核酸互補的探針，莖長 / 29 (%，由與靶序列無關的互補